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高國政 顏錦1
(蘇州215011普強蘇州制藥有限公司;1蘇州215011蘇州中化藥品工業(yè)有限公司)
摘要
目的:研究樣品pH對細(xì)菌內(nèi)毒素測定的影響。
方法:應(yīng)用動態(tài)濁度法定量測定樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量;由細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品(RSE)制成兩種濃度的稀釋液,在14個pH量級上,與國內(nèi)外兩種鱟試劑(TAL,LAL)反應(yīng);觀察每組平均回收率。
結(jié)果:pH梯度上,兩種鱟試劑回收曲線都呈現(xiàn)三個反應(yīng)高峰,分別為pH 5.20,pH 7.83/pH6.23和pH10.55。樣品pH在6～ 8間實驗結(jié)果穩(wěn)定,4λ陽性對照的平均回收率為76.5%～ 115.9%和85.8%～ 99.8%;當(dāng)樣品pH值≤ 3或≥ 12時,細(xì)菌內(nèi)毒素試驗受到抑制,平均回收率≤ 56.8%。
結(jié)論:細(xì)菌內(nèi)毒素試驗中應(yīng)該調(diào)節(jié)檢品pH;使用TAL時,檢品pH應(yīng)預(yù)調(diào)在(6.5～ 7.5)為好;使用LAL時,檢品pH應(yīng)預(yù)調(diào)在(6.2± 0.1)或(6.7～ 7.8)為好。
關(guān)鍵詞 細(xì)菌內(nèi)毒素;pH;鱟試劑(TAL,LAL);動態(tài)濁度法
細(xì)菌內(nèi)毒素(endotoxin)主要存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的最外層,當(dāng)細(xì)菌死亡、裂解后才會釋放出來。其化學(xué)成分是磷脂-多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物,主要成分為脂多糖(lipopolysa-charide,LPS),臨床上可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克、DIC等癥狀[1]。在制藥工業(yè)中,細(xì)菌內(nèi)毒素被認(rèn)為是藥品熱原(pyrogen)的本質(zhì)[2～ 3]。作為替代家兔熱原試驗的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗已被多國藥典收載。目前,美國藥品食品管理局(FDA)承認(rèn)3種使用鱟試劑檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法,即凝膠(gel-clot)法、生色(chromogenic)法和動態(tài)濁度(kenitic-turbidimetry)法。中國藥典(1995年版)只采用凝膠法。我們應(yīng)用動態(tài)濁度法,定量測定樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素,并同時使用了東方鱟細(xì)胞裂解物(tachypleus amebocyte lysate,TAL)和美洲鱟細(xì)胞裂解物(limulus amebocyte lysate,LAL)兩種鱟試劑,以探索在細(xì)菌內(nèi)毒素試驗中,檢品pH對測試影響的程度。
1 材料和方法
1.1 試劑和儀器
美國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品(RSE),10 000 EU·瓶- 1;TAL(廈門鱟試劑廠,批號960118,靈敏度0.125 EU·ml- 1,1 ml·瓶- 1;LAL(靈敏度0.125 EU·ml- 1,5.2 ml·瓶- 1;LAL溶解水批號4M0757,內(nèi)毒素含量≤ 0.005 EU·ml- 1,pH 6.23);細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀;206型pH計;超凈工作臺。
1.2 樣品處理
氫氧化鈉(AR)經(jīng)185℃ ,4 h烘烤,配制成飽和溶液。濃鹽酸(AR)不經(jīng)處理。按中國藥典(1995年版)附錄XV F方法,配制成0.1 mol·L- 1的NaOH和HCl溶液,121 ℃滅菌3 h。配制中所用器材都除熱原。用新鮮滅菌注射用水(WFI,pH 5.61,內(nèi)毒素含量 0.03 EU·ml- 1)作稀釋液。0.1 mol·L- 1鹽酸連續(xù)4次10倍量稀釋,0.1 mol·L- 1NaOH溶液連續(xù)6次10倍量稀釋,并采用LAL溶解水(pH6.23)和WFI(pH 5.61)制成14個量級的梯度pH溶液,分別加入RSE制成含細(xì)菌內(nèi)毒素0.5 EU·ml- 1和0.125 EU·ml- 1的樣品。
1.3 測定原理和方法
一定量的細(xì)菌內(nèi)毒素和鱟試劑在37℃孵化時,混合物的濁度隨時間而變化,在反應(yīng)進(jìn)行一半(t50)時,混合物濁度的變化速率最快。細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀可自動測定各濃度值下的t50,經(jīng)分析計算后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定方法見表1。陰性對照、陽性對照、空白對照同時立時,測定結(jié)果有效。異常值的舍棄依據(jù)Smirmoffsl法(n= 4,α0.01= 1.493)。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線
1.4.1 LAL標(biāo)準(zhǔn)曲線 按USP規(guī)定方法使用RSE,配制稀釋液組,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為lg t=0.960 0- 0.386 0 lg c,r= - 0.998 8(n= 4),線性范圍0.031 3 EU·ml- 1～ 10.012 8 EU·ml- 1,λ= 0.031 3 EU·ml- 1。
1.4.2 TAL標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為lg t= 3.143 2- 0.386 8 lg c,r= - 0.997 9(n=4),線性范圍0.125 3 EU·ml- 1～ 10.816 4 EU·ml- 1,λ= 0.125 3 EU·ml- 1。
2 結(jié) 果
2.1 試驗分成3組,每組有14個樣品,其pH遞增。第1組加樣品0.2 ml(含0.5 EU·ml- 1RSE)和TAL 0.1 ml,該樣品中RSE濃度為4λ。第2組加樣品0.2 ml(含0.5 EU·ml- 1RSE)和LAL 0.1 ml。第3組加樣品0.2 ml(含0.125 EU·ml- 1RSE)和LAL 0.1 ml,該樣品中RSE濃度也為4λ。根據(jù)各樣品的t50,計算回收結(jié)果,見表2。pH在4～ 11之間,RSD為1.16%～ 12.29%,s為0.005 0～ 0.054 6,實驗的精密度較好。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種鱟試劑(TAL,LAL)在pH 5.20,pH 7.83/pH6.23和pH 10.55處均有凝集高峰,當(dāng)pH≤ 3或pH≥ 12時,細(xì)菌內(nèi)毒素試驗受到明顯抑制(平均回收率≤ 56.8%),見圖1。兩種鱟試劑在pH梯度上的回收有差別,但在pH6～ 8間,回收曲線穩(wěn)定。
2.2 以pH梯度為橫軸,繪制質(zhì)控圖。圖中可見幾何平均值( x)、最大值和最小值,可同時觀察試驗的準(zhǔn)確度和精密度。依據(jù)FDA規(guī)定,4λ陽性對照的回收應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線± 25%以內(nèi)[2],此處判斷動態(tài)濁度法檢驗有效的標(biāo)準(zhǔn)是平均回收率達(dá)到(100± 20)%,相應(yīng)的警戒線為(100±10.7)%。因此,對TAL允許測量值為(0.5±0.1)EU·ml- 1,警戒值為(0.5± 0.053 3)EU·ml- 1,見圖2。圖中顯示:TAL實驗的最佳pH為6.68～ 7.12,此時準(zhǔn)確度和精密度較為滿意,在pH 6.23和pH 7.83均有測量值逸出允許范圍。對LAL允許測量值為(0.125±0.025)EU·ml- 1,警戒值為(0.125± 0.013 3)EU·ml- 1,見圖3。圖中顯示:LAL實驗的pH值在6～ 8都滿足試驗的要求,在pH 6.23處,反應(yīng)可取得較佳回收,在pH6.68～ 7.83時,回收較為穩(wěn)定。
2.3 反應(yīng)結(jié)束后(t> 4200 s),用pH試紙測定反應(yīng)混合物pH值,結(jié)果見表3。
2.4 觀察酸堿對內(nèi)毒素的破壞作用 0.1 mol·L- 1HCl溶液加入RSE,配成含細(xì)菌內(nèi)毒素1EU·ml- 1的溶液,常溫放置3 h,加等量0.1 mol·L- 1NaOH溶液中和后,測得濃度小于0.031 3EU·ml- 1。同法做堿處理組,其測定值為0.533 3 EU·ml- 1(平均回收率為106.7%,RSD= 7.3%,n= 4)。結(jié)果表明:常溫下強酸液(pH 1)對內(nèi)毒素有較強的破壞作用,而強堿(pH 13)則無。關(guān)于酸或堿對內(nèi)毒素的滅活還須進(jìn)一步研究。
3 討 論
3.1 鱟血細(xì)胞溶解物中的凝固酶原,能夠被微量的細(xì)菌內(nèi)毒素激活生成凝固酶,促使可凝蛋白向凝固蛋白轉(zhuǎn)化,最終形成凝膠樣物質(zhì),這是一個極復(fù)雜的鏈?zhǔn)矫冈磻?yīng)[4]。該反應(yīng)極其靈敏,凝膠形成速率與內(nèi)毒素濃度成正比,并受溫度、反應(yīng)物中Ca2+/Mg2+離子濃度和pH等因素的影響[4～ 5],溫度和pH值的差異直接會影響到多種因子和蛋白質(zhì)的活性,影響可凝蛋白的轉(zhuǎn)化和凝膠的形成,引起結(jié)果的差異。
3.2 在細(xì)菌內(nèi)毒素試驗中，對于樣品PH問題，《美國藥典XX版》規(guī)定PH在6-7.5之間，美國藥典XXⅢ版中此項規(guī)定放寬至PH6-8[6~8]，英國藥典（1993年版）規(guī)定為PH6.5~7.5[5]。中國藥典(1995年版)對此未作具體規(guī)定。根據(jù)國內(nèi)外資料的報道,試驗的最適pH在6～ 7.5,6.25～7.25或6～7等,這些結(jié)論多是以凝膠法中凝膠強度的細(xì)微差別來判斷,存在較大的主觀差異,國內(nèi)也有報道認(rèn)為大輸液不用調(diào)pH值。我們認(rèn)為pH的調(diào)節(jié)是必要的,即使樣品pH在6～8之間,仍存在規(guī)律性的變化,因而不同次的測定中,應(yīng)調(diào)節(jié)檢品pH值,盡量與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作(或鱟試劑靈敏度復(fù)核)時的pH相一致。
3.3 我們應(yīng)用動態(tài)濁度法,儀器和操作者資格均經(jīng)過驗證。本法使用0.2 ml的樣品和0.1ml的鱟試劑反應(yīng),樣品使用量比凝膠法大,因此兩種測試方法中pH對細(xì)菌內(nèi)毒素測定的影響可能不完全一樣,但從混合物最終pH來看(表3),鱟試劑本身具有一定的緩沖能力。當(dāng)樣品pH在5.20～ 9.17時,用pH試紙測得混合物pH基本為7,在這個范圍內(nèi),動態(tài)濁度法仍顯示了不同pH對測定結(jié)果有較大影響,其原因可能是混合物最終pH的細(xì)微差異會較大程度地影響凝膠的形成,但也不排除樣品pH對鱟試劑中活性成分的影響,從這個角度講,在pH問題上,兩種測試方法是一致的。
3.4 細(xì)菌內(nèi)毒素試驗用于臨床細(xì)菌內(nèi)毒素血癥(endotoxemia)和注射劑如粉針、水針及生物制品的測試時,由于這些檢品本身具有一定的緩沖能力,當(dāng)其pH越偏離6～ 8之間時,對細(xì)菌內(nèi)毒素測定的影響也會越大。
參考文獻(xiàn)（略）
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