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腸功能恢復(fù)湯對MODS大鼠細菌和內(nèi)毒素移位及血清MDA和SO
作者：王春榮，程永剛，曾 津 作者單位：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1. 普通外科；2. 泌尿外科，陜西西安 710061
【摘要】
目的 通過建立SD大鼠MODS模型，觀察腸功能恢復(fù)湯對多器官功能障礙綜合征(MODS)大鼠細菌和內(nèi)毒素移位及血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的影響，探索MODS新的防治途徑。
方法 SD大鼠57只，隨機分為對照組、MODS模型組、腸功能恢復(fù)湯治療組和氨芐西林治療組，分別檢測各組外周靜脈血、門靜脈血及回腸內(nèi)容物的內(nèi)毒素含量，測定血清MDA、SOD含量和ALT、AST、Cr及BUN含量，同時取腸系膜靜脈血、腸系膜淋巴結(jié)、肝、腎、肺和脾組織進行細菌培養(yǎng)，觀察細菌移位情況，取回腸組織制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。
結(jié)果 模型組、腸功能恢復(fù)湯組和氨芐西林組的肝腎功能受到明顯的損害，回腸黏膜不同程度發(fā)生上皮細胞水腫、壞死、脫落、絨毛損傷斷裂、炎細胞浸潤；腸功能恢復(fù)湯組與模型組相比，外周血、門靜脈血及回腸內(nèi)容物的內(nèi)毒素含量、血清MDA、ALT、AST、Cr及BUN含量均顯著降低(P<0.01)，SOD含量顯著升高(P<0.01)，但氨芐西林組與模型組相比上述指標差異不明顯(P>0.01)。在模型組與氨芐西林組內(nèi)，MDA和SOD的含量呈負相關(guān)(P<0.01)。腸功能恢復(fù)湯組和氨芐西林組的細菌移位率均比模型組低，二者間無顯著性差異(P>0.01)。結(jié)論 腸功能恢復(fù)湯能抑制MODS大鼠的細菌、內(nèi)毒素移位和氧化抗氧化失衡。
【關(guān)鍵詞】 腸功能恢復(fù)湯；多器官功能障礙綜合征(MODS)；細菌和內(nèi)毒素移位；丙二醛(MDA)；超氧化物歧化酶(SOD)
器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是臨床上常見的危重癥之一。腸道不僅在維持機體正常營養(yǎng)及生理機能中起著極其重要的作用，同時還活躍地參與創(chuàng)傷、燒傷和感染后的各種應(yīng)激反應(yīng)，是MODS發(fā)生的始動器官[12]。近年來，國內(nèi)已有很多學(xué)者[34]應(yīng)用中醫(yī)“通里攻下”的理論，對MODS的防治作了較為深入的研究。研究結(jié)果表明：通里攻下法可有效保護腸黏膜屏障，減少細菌和內(nèi)毒素移位，減輕全身炎性反應(yīng)和降低血清內(nèi)毒素水平。腸功能恢復(fù)湯由大黃、丹參等10余味中藥組成，具有通里攻下、活血化淤等作用。本實驗通過建立SD大鼠MODS模型，觀察腸功能恢復(fù)湯對MODS大鼠細菌和內(nèi)毒素移位及血清丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量的影響，探索MODS新的防治途徑。
1 材料與方法
1.1 材料 SD大鼠57只，清潔級，雌雄不限，體重(248.3±16.3)g。T6型新世紀紫外分光光度計；超速離心機；OLYPAS光學(xué)顯微鏡(日本)；顯色基質(zhì)鱟試劑盒和除熱原耗材均購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；MDA、SOD、ALT、AST、Cr、BUN試劑盒，氨芐西林。
腸功能恢復(fù)湯由大黃20g(后放入)、丹參12g、黨參15g、白術(shù)15g、陳皮15g、木香12g、桃仁12g、赤芍15g、火麻仁30g、枳實12g等組成。濃縮煎制成濃度為1∶1的藥液(含生藥1g/mL)，滅菌處理后4℃冰箱內(nèi)保存。
1.2 MODS動物模型的建立 通過腸缺血再灌注聯(lián)合盲腸結(jié)扎穿孔法建立大鼠MODS模型[56]。大鼠于造模前24h禁食，自由飲水。稱重后給予腹腔注射100mL/L水合氯醛(30mg/100g)麻醉，實驗臺上仰臥固定，腹部脫毛后常規(guī)消毒鋪無菌巾，取腹部正中切口進腹，暴露腸系膜上動脈(superior mesenteric artery, SMA)，各組分別用無創(chuàng)夾夾閉其根部45min，松夾即為再灌注。在進行SMA夾閉期間，間斷地向腹腔內(nèi)注射等滲鹽水，總量約15～20mL/kg，以預(yù)防或減輕在松開動脈夾后出現(xiàn)的一過性低血容量反應(yīng)。同時，游離盲腸，注意保護腸系膜血管，找到盲腸與回結(jié)腸交界處，距回盲交界約1cm處游離出回盲動脈，于動脈弓內(nèi)側(cè)，穿過4號絲線，并環(huán)行結(jié)扎盲腸，注意保持回結(jié)腸通暢。在盲腸游離端用9號針頭貫穿2次穿孔，直徑約2mm，將盲腸放回腹腔后關(guān)腹。建成大鼠MODS模型。
1.3 動物分組 57只大鼠隨機分為3組，正常對照組(control group)12只：正常大鼠腸功能恢復(fù)湯灌胃；MODS模型組(MODS group)15只：造模后生理鹽水灌胃；腸功能恢復(fù)湯治療組(decoction group)15只：造模后即給予腸功能恢復(fù)湯灌胃；以上三組均10mL/kg體重，2次/d，連續(xù)2d。氨芐西林治療組(ampicillin group)15只：造模后即給予氨芐西林灌胃，89.25mg/kg體重，2次/d，連續(xù)2d。
1.4 血清內(nèi)毒素含量的測定 各組動物于造模成功48h后，用100mL/L水合氯醛(30mg/100g)麻醉，嚴格無菌操作下用無熱原注射器采取門靜脈血、外周血，迅速低溫離心10min(1000r/min)，吸出上清液，以鱟試驗偶氮基質(zhì)顯色法定量測定，結(jié)果以eu/mL表示，嚴格按說明書操作。
1.5 回腸內(nèi)容物的內(nèi)毒素含量的測定 各組造模動物于麻醉后取回腸末端內(nèi)容物，稱重后加入無熱原鹽水混勻并離心(4℃，5000r/min，10min)。上清液以無熱原水連續(xù)10倍稀釋6次后以鱟試驗偶氮基質(zhì)顯色法定量測定，結(jié)果以106 eu/g表示。
1.6 MDA和SOD含量的測定 MDA用硫代巴比妥酸法(TBA法)測定，SOD用黃嘌呤氧化酶法測定，均嚴格按說明書操作。
1.7 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐和尿素氮含量的測定 各組動物于造模成功48h后，于麻醉狀態(tài)下，嚴格無菌操作下采取下腔靜脈血，用賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的含量，用脲酶法測血清尿素氮(BUN)的含量，用除蛋白法測血清肌酐(Cr)的含量。
1.8 細菌的培養(yǎng) 各組動物于造模成功48h，麻醉后無菌條件下打開腹腔，分別取腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node, MLN)、肝、腎、肺及脾組織各0.5g，加入生理鹽水1mL制成勻漿，取勻漿液0.5mL，接種于直徑10cm的中國蘭培養(yǎng)基平皿內(nèi)，同時取腸系膜上靜脈血0.5mL加入培養(yǎng)基中作細菌培養(yǎng)，37℃條件下孵育48h，如果培養(yǎng)基平皿菌落數(shù)多于100個/g組織記為細菌培養(yǎng)陽性，細菌移位率按細菌培養(yǎng)的陽性臟器數(shù)/培養(yǎng)臟器總數(shù)計算。
1.9 小腸黏膜病理形態(tài)學(xué)的觀察 各組動物于造模成功48h，麻醉后于距盲腸5cm處取回腸組織，100mL/L甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE 染色，光鏡下觀察。
1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。進行完全隨機設(shè)計資料的多個樣本均數(shù)比較的單因素方差分析，如差異有顯著性意義，采用SNKq檢驗進行多個樣本均數(shù)間多重比較。細菌移位率采用Fisher確切概率法進行檢驗。相關(guān)性檢驗采用線性相關(guān)分析。P<0.01認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 MODS模型組大鼠的一般情況和死亡率的變化 模型組動物于造模6h后即表現(xiàn)出反應(yīng)遲鈍、活動減少、腹瀉、呼吸窘迫、足尾潮紅、口唇發(fā)紺等表現(xiàn)，開腹后可見腹腔內(nèi)大量膿性滲出液，腸蠕動極弱甚至消失，腸漿膜面充血水腫，表面有膿苔，肝臟水腫，表面可見大量出血點，總死亡率為33.33%。腸功能恢復(fù)湯組的總死亡率為26.67%，氨芐西林組的總死亡率為33.33%，兩組大鼠的一般情況和開腹后所見均好于模型組。
2.2 模型組和腸功能恢復(fù)湯組大鼠回腸組織的病理學(xué)觀察 光鏡顯示模型組回腸黏膜上皮細胞水腫、壞死、部分脫落、絨毛損傷斷裂和炎細胞浸潤(圖1A)，腸功能恢復(fù)湯組的病理形態(tài)較模型組好(圖1B)。
2.3 各組大鼠血清ALT、AST、BUN和Cr含量的比較 模型組、腸功能恢復(fù)湯組和氨芐西林組的肝、腎功能受到明顯的損害，腸功能恢復(fù)湯組與模型組相比，血清中ALT、AST、BUN和Cr含量均顯著降低(P<0.01)，但氨芐西林組與模型組相比上述指標差異不明顯(P>0.01，表1)。
2.4 各組大鼠門靜脈血、外周血和回腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素含量的比較 腸功能恢復(fù)湯組與模型組相比，外周血、門靜脈血及回腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素含量均明顯降低(P<0.01)，而氨芐組與模型組相比上述指標差異不顯著(P>0.01，表2)。 表1 各組大鼠血清ALT、AST、Cr和BUN含量的比較表2 各組大鼠外周血、門靜脈血及回腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素含量的比較
2.5 各組大鼠細菌移位情況的比較 正常對照組大鼠僅在MLN中培養(yǎng)出細菌；模型組細菌移位率最高，為88.33%；腸功能恢復(fù)湯組細菌移位率為43.94%，氨芐西林治療組細菌移位率為46.67%，二者與模型組相比，細菌移位率顯著下降(P<0.01)，二者間差異不顯著(P>0.01，表3)。表3 各組大鼠細菌移位情況的比較
2.6 各組大鼠血清MDA和SOD含量的比較 腸功能恢復(fù)湯組與模型組相比，MDA含量明顯降低(P<0.01)，SOD明顯升高(P<0.01)，而氨芐西林組與模型組相比，MDA和SOD含量差異不明顯(P>0.01)。在模型組與氨芐西林組內(nèi)，MDA和SOD的含量呈負相關(guān)(r=-0.864，P<0.01；r=-0.808，P<0.01，表4)。表4 各組大鼠血清MDA和SOD含量的比較
3 討 論
本研究通過小腸缺血再灌注聯(lián)合盲腸結(jié)扎穿孔法建立SD大鼠MODS模型，結(jié)果顯示，模型組的肝腎功能受到明顯的損害，肝臟水腫，表面可見大量出血點，腸蠕動極弱甚至消失，腸漿膜面充血水腫，表面有膿苔。表明已成功建立SD大鼠MODS模型。腸功能恢復(fù)湯能顯著減輕MODS大鼠的細菌和內(nèi)毒素移位，并抑制氧化抗氧化系統(tǒng)的失衡。
腸功能恢復(fù)湯由大黃等10余味中藥組成，大黃導(dǎo)熱瀉下，火麻仁潤腸通便，枳實行氣破結(jié)，白術(shù)、陳皮健脾和胃，黨參益氣補中，丹參活血通經(jīng)，桃仁、赤芍活血化淤，木香行氣。在我院已有三十余年的臨床應(yīng)用，具有促進腸蠕動，促進術(shù)后胃腸道功能恢復(fù)及腸道營養(yǎng)吸收等作用，但對細菌和內(nèi)毒素移位和機體氧化抗氧化系統(tǒng)的影響目前尚未有相關(guān)研究。
目前，國內(nèi)外對MODS的發(fā)病機制有三種假說：即腸道細菌與內(nèi)毒素移位學(xué)說、微循環(huán)障礙學(xué)說和細胞因子和炎癥介質(zhì)學(xué)說[7]。當(dāng)機體遭受嚴重創(chuàng)傷、休克、感染等打擊后，可相繼出現(xiàn)多種細胞因子及炎性介質(zhì)的瀑布樣釋放和一系列病理生理改變；腸道菌群生態(tài)平衡破壞，革蘭氏陰性細菌過度生長，腸黏膜屏障破壞等而導(dǎo)致腸道細菌與內(nèi)毒素移位，出現(xiàn)敗血癥及內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素又可激活巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞等，釋放多種炎性介質(zhì)，形成惡性循環(huán)。因此，保護腸黏膜屏障及其功能，抑制細菌和內(nèi)毒素移位，阻滯這一惡性循環(huán)，對于MODS的防治具有十分重要的意義。
本研究發(fā)現(xiàn)，MODS模型組大鼠發(fā)生了明顯的細菌和內(nèi)毒素移位，腸功能恢復(fù)湯治療組的外周血、門靜脈血和回腸內(nèi)容物中內(nèi)毒素含量明顯降低，肝、腎等臟器的細菌移位率明顯降低。其機制可能有以下幾點：①腸功能恢復(fù)湯對腸道內(nèi)內(nèi)毒素的稀釋和物理沖洗作用減低了內(nèi)毒素的濃度；②火麻仁、白術(shù)[8]可以促進胃腸道蠕動，從而加速了腸道內(nèi)細菌和內(nèi)毒素的排出，同時抑制細菌的定植，減少了內(nèi)毒素的產(chǎn)生；③大黃、木香、丹參、黨參[8]均有不同程度的抗菌作用，可以抑制腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡紊亂，保護腸黏膜的生物屏障。此外，丹參、黨參等還有擴張胃腸道血管、改善微循環(huán)和促纖溶、抗血栓形成的作用，以此保護腸黏膜，減輕了內(nèi)毒素移位。氨芐西林等抗生素雖然有較強的抗菌能力，但在大量殺滅敏感細菌的同時，因菌體破裂而產(chǎn)生更多的內(nèi)毒素，還可能破壞腸道細菌的微生態(tài)平衡，破壞腸道生物學(xué)屏障從而進一步加重細菌和內(nèi)毒素移位及其對機體的損傷。
本研究發(fā)現(xiàn)，腸功能恢復(fù)湯可以抑制MODS大鼠的氧化抗氧化系統(tǒng)失衡。而氨芐西林的這一作用不明顯。其機制可能為：①大黃、丹參、桃仁等的中藥成分增強了機體的抗氧化能力，抑制了活性氧類物質(zhì)對細胞的損傷；②黨參、丹參等可以改善微循環(huán)和促纖溶，保護組織細胞，減少活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生；③腸功能恢復(fù)湯能減少腸道內(nèi)內(nèi)毒素的產(chǎn)生，減輕細菌和內(nèi)毒素的移位，從而保護肝、腎、肺等重要組織器官的功能，更好地維持機體氧化抗氧化系統(tǒng)的平衡。
綜上所述，與傳統(tǒng)的“通里攻下”湯劑大承氣湯相比，腸功能恢復(fù)湯從多方位、多途徑顯著減輕MODS大鼠的細菌和內(nèi)毒素移位，抑制氧化抗氧化系統(tǒng)的失衡，但其具體機制還有待于進一步深入研究。
參考文獻（略）
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