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顯色基質法檢測乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液細菌內毒素含量
彭燕 張玲莉 王宗春（武漢大學人民醫(yī)院)
[摘要]
目的：建立快速的乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液細菌內毒素定量檢查法。
方法：使用顯色基質鱟試劑對不同批號的乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液分別進行干擾試驗考察確立乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液內毒素定量檢查法。
結果：表明標準曲線的線性相關系數(shù)r≥0.98,乳酸左氧氟沙星在2mg.ml-1濃度無干擾作用。
結論：顯色基質法與凝股法比較，有靈敏、快速、能定量、重復性好的特點，可用于乳酸左氧氟沙星內毒素含量的測定。
關鍵詞 顯色基質鱟試劑法；細菌內毒素；干擾實驗；熱原；乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液
細菌內毒素檢查法主要用于檢測注射用藥品中可能出現(xiàn)的內毒素污染，以此控制藥品中熱原的含量。近年來很多分析檢驗工作者進行相關藥物的研究探討消除細菌內毒素干擾辦法。本文對乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素檢測進行了相應的研究，建立了顯色基質法檢測該藥的細菌內毒素能更快速準確的實現(xiàn)內毒素質量控制。
1.材料與試劑
1.1顯色基質鱟試劑盒
鱟試劑（批號：120402）1.7ml ；顯色基質（批號：120403）1.7ml；內毒素標準品（CSE）（批號：120401）10EU；細菌內毒素檢測用水（BET）（批號：120418）50ml；偶氮化試劑1（批號120326）10ml；偶氮化試劑2（批號120327）10ml；偶氮化試劑3（批號120328）10ml；HCL反應終止劑（批號120329）50ml。以上產品全部為廈門鱟試劑廠生產。
1.2樣品
乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液，規(guī)格：100ml含乳酸左氧氟沙星0.2g與氯化鈉0.9g）
1.3儀器和材料
除熱原玻璃反應試管（10mm*75mm試管）、除熱原吸頭、除熱原空安瓿（廈門鱟試劑實驗廠有限公司）試管架，盛冰水托盤，計時器，渦旋混合儀，精密恒溫水浴鍋，紫外可見分光光度計，玻璃比色皿，定量可調移液器。
2.方法與結果
2.1 供試品內毒素限值的確定
細菌內毒素限值L=K/M，式中K為人每千克體質量每小時最大可接受的細菌內毒素劑量，注射劑為5EU.kg-1.h-1；M為人用每千克體質量每小時的最大供試品劑量，按照乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液說明書用法用量，成人一次0.4~0.6g靜脈滴注維持，約60min滴完，按靜注最大劑量600mg納入計算，1h接受的最大劑量為600mg（人均體質量按60kg計算），則1h的M=10mg.kg-1.h-1。因此，本品的細菌內毒素限值L=0.5EU.mg-1、由于本品的濃度為2mg.ml-1即L=1EU.ml-1。
2.2 標準曲線可靠性試驗
取CSE1支，加入1ml BET水復溶，放置旋渦混合器上旋渦混合15min，得到10EU.ml-1溶液，然后用BET水將其稀釋至1EU.ml-1溶液，再分別取2ml反應試管15支 ，分別加入細菌內毒素母液1EU.ml-1（0.8，0.6，0.4,0.2,0.0ml）和細菌 內毒素檢查用水（0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml） 制成不同濃度的細菌內毒素標準溶液（0.8，0.6，0.4, 0.2, 0.0EU.ml-1），每個濃度平行配制三管，每步稀釋內毒素過程均需震蕩30s。各取標準溶液0.1ml分別加到預先加有0.1ml鱟試劑的反應試管中（冰?。?，震蕩10s。然后置于37℃水浴箱中10min，取出置冰浴中，加入顯色基質0.1ml，再置入37℃水浴箱中6min，取出置冰浴中，依次加入偶氮試劑一，偶氮試劑二，偶氮試劑三各0.5ml。震蕩5s后靜置5min，在紫外可見分光光度計中檢測545nm處吸光度（A），減去空白對照管平均A值。以Δ平均A值對內毒素濃度作線性回歸，得標準曲線Y=0.7545X+0.0198，r=0.9970,r≥0.980表明實驗有效。
2.3樣本的干擾實驗
將批號為1130151、1121258、1130266的乳酸左氧氟沙星注射液樣品加入BET，稀釋為1:2,1:4,1:8,1:16倍數(shù)四個稀釋級（稱為NPC溶液），分別用四個不同稀釋級供試品溶液加入1EU.ml-1內毒素標準品，配制濃度為0.5EU.ml-1內毒素溶液（稱為PPC溶液）;測量出PPC系列和NPC系列吸光度，用標準曲線計算內毒素濃度，加入外源內毒素的供試品溶液內毒素（Cs），未加外源內毒素的相同稀釋倍數(shù)供試品溶液內毒素濃度（Ct），按公式計算該條例下的回收率R=（Cs-Ct）/0.5×100%，不同稀釋倍數(shù)樣品檢測A值及回收率，見表1。
結果顯示，1:2倍樣品稀釋溶液有一定干擾作用，1:4，1:8,1:16倍稀釋的供試品均無抑制作用，回收率在50%~100%之間。
2.4樣品的測定
選擇樣品稀釋1:4溶液作為供試品溶液檢查各批樣品內毒素含量，試驗過程不用加入細菌內毒素原液其余加樣量同標準曲線制定。供試品內毒素含量的測定，不同批號乳酸左氧氟沙星內毒素檢測結果見表2。
3.討論
3.1顯色基質法是繼家兔法，凝膠法后被納入《中國藥典》2005年版的法定內毒素檢測法，此法是鱟試劑檢查法進一步地發(fā)展和提高。由于其具有快速、靈敏度高、可定量、重復性好的特點。已被廣泛應用于樣品內毒素含量檢測。與凝膠法相比，樣品抗干擾能力加強，使用凝膠法測定左氧氟沙星注射液細菌內毒素含量，有文獻[1,2]顯示，凝膠法測定乳酸左氧氟沙星注射液必須稀釋1:16或1:8以后才能排除干擾，進行半定量檢測。而顯色基質法抗干擾能力好，能夠定量測定樣品中的細菌內毒素含量，比凝膠法實驗結果更準確，科學。
3.2《中國藥典》規(guī)定，細菌內毒素含量定量方法主要有動態(tài)濁度法、終點濁度法、動態(tài)顯色基質法和終點顯色基質法，相比其他測定細菌內毒素含量，終點顯色基質法采用混合物中細菌內毒素濃度和其在孵育終點是釋放出成色團的數(shù)量之間存在量化關系測定內毒素的含量，方法通過檢驗特定波長中吸光度大小；來定量，具有更好的重復性和可操作性。實驗條件簡單易行，僅需要可見分光光度計和玻璃比色皿，不需要特別的實驗儀器，在實驗條件比較簡單的實驗室或生產廠家均可開展，其他的檢驗方法通常需要酶標儀或者特定的細菌內毒素檢查用設備，因此在實際工作中該方法具有更好的推廣應用前景。
3.3顯色基質法除了對試驗用品和稀釋液要求無熱原外，對鱟試劑靈敏度，內毒素標準曲線，試驗樣品的干擾試驗也有明確的規(guī)定和要求[3,4]，其中樣品的干擾試驗是保證試驗結果準確性的關鍵因素。用供試品溶液配制內毒素回收率在規(guī)定的范圍內，試驗方為有效[5]。目前，排除干擾通常采用樣品稀釋法和其他適宜的方法。通過試驗證明，如果用乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液1:4稀釋液作內毒素含量檢查，可以達到較好的回收率。本文提供了定量測定乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中細菌內毒素含量的方法。
參考文獻（略）
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